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1儀器與條件

LC-10T高效液相色譜儀（中國(guó)，Science公司);SPD-10T紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm，柱溫：40℃，VI2010色譜工作站，VI-11手動(dòng)進(jìn)樣閥（日產(chǎn)），VertexC18液相色譜柱，柱溫箱,離心機(jī)（8000轉(zhuǎn)以上轉(zhuǎn)速），電子天平，氮催儀，固相萃取。

(1)VertexC18(4.6×250mm);緩沖液：10mM檸檬酸,10mM庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min。

(2)VertexC8(4.6×250mm);流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15;緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0;流速：1.0mL/min;

離子交換固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰爾科技有限公司)

2試劑與樣品 　寵物飼料樣品(農(nóng)業(yè)部飼料供應(yīng)中心提供);甲醇、乙腈為北京艾杰爾科技有限公司提供;氨水、乙酸鉛、三氯乙酸、均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司;三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、辛烷磺酸鈉(Sigma公司);甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1樣品前處理方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：

取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，以提取液(0.1%三氯乙酸)稀釋至所要的濃度。

(2)提取：

稱取飼料樣品5g，加入50ml0.1%三氯乙酸提取液，充分混勻，加入2mL2%乙酸鉛溶液，超聲20min。

然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，8000rpm/min離心10min，取上清液3mL過(guò)混合型陽(yáng)離子交換小柱(PCX)。

(3)凈化(PCX小柱，60mg/3mL)：

a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水

b)上樣：加入提取液3mL

c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;棄去淋洗液并將小柱抽干。

d)洗脫：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脫。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。

e)濃縮：50℃，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。

3.2HPLC檢測(cè)方法 　三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，在傳統(tǒng)的反相C18柱上保留很差，需要用離子對(duì)試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的三聚氰胺檢測(cè)方法和中國(guó)農(nóng)業(yè)部公布的三聚氰胺檢測(cè)方法，采用Vertex系列親水色譜柱，可以得到良好的分離效果，分析色譜圖如下：

3.2.1三聚氰胺HPLC-UV檢測(cè)方法

(a)色譜柱：VertexC84.6×250mm;標(biāo)準(zhǔn)：FDA方法;流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15;緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0;流速：1.0mL/min;柱溫：40oC;波長(zhǎng)：240nm

(b)色譜柱：VertexC184.6×250mm;標(biāo)準(zhǔn)：中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)方法;緩沖液：10mM檸檬酸,10mM庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱溫：40℃;波長(zhǎng)：240nm